更新時間：2025-04-07
生物樣品掃描電鏡常規(guī)掃描電鏡對樣品要求:必須是干燥的，不含水分或揮發(fā)性物質(zhì);具有一定機械強度,能耐受電子束轟擊；具有導電性，被激發(fā)時能夠產(chǎn)生足夠的二次電子。生物材料特點:含水分多，質(zhì)地柔軟，機械強度小;組成元素的原子序數(shù)低，導電性差,激發(fā)后二次電子的產(chǎn)額較少。制樣的任務:通過一系列處理,既要盡量地保存材料的固有形態(tài)，又要改良其物理性能，使其適合在電鏡下觀察成像。
生物樣品掃描電鏡簡稱為掃描電鏡，英文縮寫SEM（Scanning Electron Microscope）。它是用細聚焦的電子束轟擊樣品表面，通過電子與樣品相互作用產(chǎn)生的二次電子、背散射電子等對樣品表面或斷口形貌進行觀察和分析。SEM已廣泛應用于材料、冶金、礦物、生物學領域。
通常人眼能夠分辨的最小距離為0.2MM，為了觀察分析更微小的細節(jié)，人們發(fā)明了各種觀察儀器。
首先出現(xiàn)的是光學顯微鏡，它利用可見光作為照明束照射樣品，再將照明束與樣品的作用結(jié)果由成像放大系統(tǒng)處理，構(gòu)成適合人眼觀察的放大像。一般而言光學顯微鏡能分辨的最小距離約為200um，是人眼的一千倍。
為突破光學顯微鏡的分辨極限，人們想到用電子束做照明束，并與上個世紀三十年代制造出了第一臺掃描電子顯微鏡。它的分辨率已經(jīng)達到了原子水平（≈0.1um），比光學顯微鏡提高了近兩千倍。
掃描電子顯微鏡組成部分
電子光學系統(tǒng)
組成：電子槍、電磁透鏡、掃描線圈和樣品室等部件。
作用：獲得掃描電子束、作為產(chǎn)生物理信號的激發(fā)源。
信號收集和顯示系統(tǒng)
信號收集：二次電子和背散射電子收集器、吸收電子顯示器、X射線檢測器（波譜儀和能譜儀）
顯示系統(tǒng)：顯示屏有兩個，一個用于觀察，一個用于記錄照相。
掃描電子顯微鏡的應用
掃描電鏡觀察納米材料
所謂納米材料就是指組成材料的顆粒或微晶尺寸在0.1-100nm范圍內(nèi)，掃描電鏡的一個重要特點就是具有很高的分辨率?，F(xiàn)已廣泛用于觀察納米材料。
掃描電鏡觀察材料斷口
掃描電鏡所顯示的斷口形貌從深層次，高景深的角度呈現(xiàn)材料斷裂的本質(zhì)，在教學、科研和生產(chǎn)中，有不可替代的作用，在材料斷裂原因的分析、事故原因的分析已經(jīng)工藝合理性的判定等方面是一個強有力的手段。
掃描電鏡觀察大試樣的原始表面
掃描電鏡能夠直接觀察直徑100mm，高50mm，或更大尺寸的試樣，對試樣的形狀沒有任何限制，粗糙表面也能觀察，這便免除了制備樣品的麻煩，而且能真實觀察試樣本身物質(zhì)成分不同的襯度(背反射電子象)。
生物樣品掃描電鏡常規(guī)掃描電鏡對樣品要求:必須是干燥的，不含水分或揮發(fā)性物質(zhì);具有一定機械強度,能耐受電子束轟擊；具有導電性，被激發(fā)時能夠產(chǎn)生足夠的二次電子。生物材料特點:含水分多，質(zhì)地柔軟，機械強度小;組成元素的原子序數(shù)低，導電性差,激發(fā)后二次電子的產(chǎn)額較少。制樣的任務:通過一系列處理,既要盡量地保存材料的固有形態(tài)，又要改良其物理性能，使其適合在電鏡下觀察成像。
電鏡是進行材料表征時用到一種重要工具，幫助觀察材料的微觀形貌。然而，在觀察軟/濕生物材料時(離體組織，帶細胞材料等)，涉及到觀察樣品的固定、脫水、干燥、金屬濺射等步驟，處理復雜，耗時較長。
冷凍的水凝膠觀察
生物樣品掃描電鏡的構(gòu)成：
樣品室：放置樣品，并安裝有各種信號探測器。
?。?）信號收集及顯示系統(tǒng)：收集樣品在入射電子束作用下產(chǎn)生的各種信號，二次電子、背散射電子、特征X射線等，并進行放大轉(zhuǎn)換顯示在顯示系統(tǒng)上像。
?。?）真空系統(tǒng)：場發(fā)射電子顯微鏡的電子槍需要高真空度，所以配有2臺離子泵，1臺分子泵和一臺機械抽空泵。
?。?）電源系統(tǒng)：包括啟動的各種電源，檢測-放大系統(tǒng)，真空系統(tǒng)和成像系統(tǒng)等。
分辨率的下降，掃描樣品在干燥過程中，由于失去水分會造成組織和細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生皺縮。此外，液體巨大的表面張力，將對細胞超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴重的影響。因此，生物樣品的干燥是掃描制備中的關鍵。樣品觀察表面必須具有良好的導電性和較高的二次電子發(fā)射率
生物樣品掃描電鏡掃描圖像的質(zhì)量與樣品受激發(fā)產(chǎn)生的二次電子的多少有很大的關系。對于一幅由10°個像素組成的圖像，生物樣品掃描電鏡掃描探針在樣品的每個掃描點上要產(chǎn)生平均6個二次電子，對于生物樣品，一般只能產(chǎn)生0.1~2個二次電子，使得圖像的質(zhì)量與分辨率均受到影響。另一方面由于生物樣品的導電性較差，入射電子在樣品表面堆積，容易形成充放電現(xiàn)象，造成忽亮忽暗、全黑全白、圖像錯位等反常圖像。因此，提高樣品的導電性、消除充放電效應和增強二次電子發(fā)射率是生物樣品掃描制備的另一個基本要求。
低真空下電鏡觀察葉子氣孔
樣品觀察表面必須保持其在活休狀態(tài)時的形貌。在樣品處理中要去掉覆蓋在表面的灰塵、粘液、蠟質(zhì)等雜質(zhì)。此外，取樣時避免機械損傷。
含水的生物樣品在真空條件下極易揮發(fā)，因此，在掃描觀察時樣品必須干燥，以防水分的蒸發(fā)影響儀器的真空度
2.在樣品制備的過程中應始終保持樣品濕潤，切勿讓樣品干裂；
3.由于掃描電鏡觀察樣品表面，因此一定要沖洗干凈樣品表面的殘余雜質(zhì)；
4.較大樣品需將樣品切成片狀，厚度不超過2-3mm。
選取觀察材料需根據(jù)材料的特性與觀察目的的不同，采取不同的方法。取樣的基本要求:取材動作迅速;取材部位準確;固定及時;避免機械損傷。體積的大小沒有太大的限制，觀察表面的面積通常不超過10mm×10mm，厚度約兒個毫米。對于一些微小的單體材料（如游離細胞、細菌、線蟲等)，取樣時應注意材料數(shù)量要取夠，防止在制備過程中由于丟失造成材料不足而影響觀察。對于樣品斷裂面的獲取最好采用冷凍斷裂的方法。
用清洗液清洗去除樣品表面的灰塵、粘液、油脂、蠟質(zhì)等，可使樣品表面充分暴露。清洗液有雙蒸水、生理鹽水、含酶的清洗液、各種緩沖液、有機溶劑等。清洗的方法可采用氣吹、沖洗、刷洗、超聲波清洗等方法。清洗過程中要避免對樣品表面細微結(jié)構(gòu)損傷。清洗的具體做法可根據(jù)研究l的、樣品性質(zhì)和樣品對環(huán)境變化的敏感程度選用不同的清洗液和清洗方法。
固定劑的種類、配制方法、固定時間和操作條件及要求與透射電鏡樣品固定處理基木相同。
掃描電鏡樣品脫水的目的是用脫水劑取代樣品中的游離水，為了使樣品在干燥過程中，避免樣品中水分直接蒸發(fā)時產(chǎn)生巨大的表面張力(水的表面張力在20℃時達46000kg/cm3),使樣品結(jié)構(gòu)遭到損傷。常用的脫水劑是乙醇和丙酮，采用等梯度系列脫水的方法，脫水時間間隔5~15分鐘。在100%脫水劑中要過2~3次。
螨蟲自然風干電鏡直接觀察
2、如果需要研究樣品表面的形態(tài)結(jié)構(gòu),如細胞的外形、細胞的生長形態(tài)等,則應選擇掃描電鏡觀察
生物樣品取材、固定、保存
1) “快速”：指盡量在活體條件下取材或動物斷血后2分鐘內(nèi)取材,并迅速將組織放入電鏡專用3.5%戊二醛固定液內(nèi)(不可用酒精或消毒級戊二醛固定),并于4℃冰箱內(nèi)保存,切忌樣品結(jié)冰。
2) “準確”：指取材部位要準確。取材的器械要鋒利,盡量減少對組織的牽拉和擠壓?！?/p>
3) “體積小、低溫”：指組織厚度不應大于3mm,取材溫度最好控制在4℃左右進行操作。
1) 取材時還應盡量保護觀察面,避免用鑷子夾持觀察區(qū)域,在固定前,通常應用適當?shù)那逑匆呵逑礃悠繁砻娴碾s質(zhì),灰塵,粘液等附著物。
2) 常用的清洗波有蒸餾水、生理鹽水、各種緩沖液或含酶的清洗液。
3) 樣品取好后,放入3.5%戊二醛固定液內(nèi)固定,保存在4℃冰箱中，切忌樣品結(jié)冰。
流程
取樣——3.5%戊二醛前固定；1%鐵酸后固定——酒精、丙酮逐級梯度脫水——Epon-618滲透、包理——半薄切片——光鏡選區(qū)定位——修塊——超薄切片機切片——檸檬酸鉛、醋酸鈾雙染色——透射電鏡觀察——攝片——分析+報告
1) 取材——清洗——固定——冷凍——SEM觀察（冷凍電鏡）
2) 取材——清洗——固定——脫水——干燥——鍍膜——SEM觀察（常規(guī)檢測）
3) 取材——清洗——固定——組織導電處理——脫水——SEM觀察（特殊樣品，例如外泌體）
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